超越CRISPR! 植物基因组高效无缝插入技术正式问世！

　　传统的植物基因组工程面临DNA随机插入、低效同源重组和非同源末端连接引起的缺陷问题。因此亟需一种高效的方案实现植物中大片段插入，为解决这些挑战，本文从转座酶结合 CRISPR/Cas 系统的角度进行了探索，开发了高效的 TATSI 技术。

　　2024年6月26日，Nature(IF：50.5) 在线发表了密苏里大学R. Keith Slotkin和南卡罗来纳大学C. Nathan Hancock团队合作的最新研究成果：‘Transposase-assisted target-site integration for efficient plant genome engineering’，该研究开发了转座酶辅助靶点整合(Transposase-Assisted Target-Site Integration, TATSI)技术，在植物基因组中进行高效的靶向插入。

　　研究人员将水稻Pong转座酶蛋白与Cas9或Cas12a核酸酶融合，创建了多个不同的融合蛋白配置，通过gRNA指导，这些融合蛋白能够实现转座元件mPing的靶向插入。实验验证了mPing在拟南芥PDS3基因目标位点的插入，展示了较高的插入频率和准确性。此外，mPing可以负载不同DNA元件(如增强子和基因盒)，成功实现了这些元件的靶向插入，展示了该系统在基因功能研究和作物改良中的广泛应用前景。

　　在拟南芥中，使用单组分系统进行靶向插入的效率为35.5%(未融合的ORF2和Cas9配置)。在大豆中，使用未融合的ORF2和Cas9配置，插入效率为18.2%。这些插入效率显著高于同源定向修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)方法在植物中的效率。

　　插入长度方面：标准的430bp mPing元件;含有六个热休克元件(HSEs)的444bp mPing_HSE元件;含有bar基因编码区(1002bp)的mPing_bar_CDS元件;含有bar基因表达盒(包括启动子和终止子，1563bp)的mPing_bar元件;甚至测试了一个总长度为8.6kb的mPing_EPSPS元件，该元件包含两个内源基因。TATSI系统能够成功插入这些不同长度的元件。

　　通过深度测序分析，研究发现大多数靶向插入事件发生在CRISPR切割位点附近(±4 bp)，并且插入的mPing元件大多是完整的。研究还评估了脱靶插入的情况，发现这些脱靶插入主要是由于自由转座事件，而不是CRISPR/Cas9的非特异性切割。