合成生物学是未来！利用莱茵衣藻生物反应器表达重组人红细胞生成素

　　抗体或激素等重组蛋白在生物制药市场具有良好的发展前景。目前，重组蛋白主要在中国仓鼠卵巢细胞中生产，这种类型的生产非常昂贵的。因此，人们需要开发新的、更便宜的和有效的表达系统。微藻因其独特的特征成为一种有吸引力的替代品。作为光合单细胞生物，它们的生长不需要昂贵和复杂的培养基，此外，与其他真核生物一样，它们能够在培养基中分泌蛋白质并进行蛋白质N-糖基化。一些研究报道了糖基化治疗蛋白在微藻中的表达，突出了这些生物作为创新细胞生物因子的潜力。在绿色微藻中，莱茵衣藻产生了大约10种蛋白质，包括人红细胞生成素(hEPO)、生长因子、白细胞介素2和病毒蛋白Spike的受体结合结构域。这些治疗性蛋白的翻译后修饰，包括糖基化的相关文献很少。

　　近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“Fine-tuning the N-glycosylation of recombinant human erythropoietin using Chlamydomonas reinhardtii mutants”的研究论文。作者主要研究莱茵衣藻N-聚糖免疫原性表位缺失而开发的敲除策略是否适用于治疗蛋白的糖工程，这对于进一步开发微藻生产人类相容性生物制品至关重要。

　　作者首先发现，rhEPOs在莱茵草中表达是用成熟的n-聚糖而不是寡甘草苷结构进行n糖基化。此外，PNGase F处理后出现的额外电泳带表明，三个糖基化位点在含有n-聚糖(对PNGase F有抗性)和缺乏该特异性糖表位(对PNGase F敏感)的rhEPOs中被占据，每个低迁移率的电泳带对应于rhEPO在一到三个n -糖基化位点上缺乏core-fuc的rhEPOs(图1)。

　　图1 rhEPO在莱茵衣藻的培养基中分泌，并被n -糖基化

　　糖基化突变体中rhEPOs的表达导致糖工程rhEPO的分泌缺乏免疫原性的core-Xyl和core-Fuc表位。这表明莱茵C. reinhardtii蛋白n -聚糖的o -甲基化不仅发生在甘露糖残基上，也发生在core-fuc上。无论在哪种菌株中表达rhEPO, rhEPO的三个糖基化位点都被成熟聚糖的混合物占据，其相对丰度取决于蛋白质n-糖基化位点。rhEPO的糖蛋白组学分析表明，连接在三个糖基化位点上的一些低聚糖是含有6或7个己糖的N-glycans(图2)。

　　图2莱茵衣藻 CC5325、IMXTA × IMXTB和IMXTA × IMXTB × IMFUT突变体rhEPOs三个n-糖基化位点上n-聚糖的分布

　　hEPO在S126上也显示出一个O-糖基化位点。hEPO O-聚糖是一种粘蛋白型寡糖，其GalNAc O-与丝氨酸残基连接。该研究发现，在C.reinhardtii中表达的rhEPOs上没有观察到O-聚糖。除了富含羟脯氨酸的糖蛋白外，关于C.reinhardtii中蛋白质O-糖基化的信息很少。GalNAc尚未在C. reinhardtii中报道过，因此，要获得与这种绿色微藻产生的重组治疗性蛋白O连接的人聚糖，既需要利用酶机制为高尔基体提供核苷酸-糖UDP-GalNAc，也需要表达适当的糖基转移酶，如多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶和核心β(1,3)-半乳糖转移酶类，这是形成最常见的O-聚糖延伸所必需的。