中药丹参被基因编辑！研究建立丹参原生质体再生及基因编辑体系，实现次生代谢产物表达量提升

　　丹参 (Salvia miltiorrhiza)丹参含有水溶性和脂溶性生物活性化合物，包括丹参酚酸与丹参酮，在中医中被广泛应用于治疗心血管疾病。过去的研究中，利用农杆菌转化技术进行基因编辑，以提高有效成分的产量。虽然目前有很多作物可以通过交配后选拔子代的方式得到无外源基因的基因编辑作物，但在如丹参这种高度杂合遗传背景，以及利用无性繁殖的植物，这仍然是一项极具挑战性的任务。此外，对于一些作物来说，将多细胞培植体作为基因转殖材料可能引起嵌合体的问题。在先前的许多报导中认为原生质体基因编辑及再生技术能够有效解决上述问题，进而得到没有外源基因且非嵌合体的基因编辑作物。

　　最近，中研院林崇熙博士、花莲慈济医院林钦荣院长和韩鸿志教授的团队在Plant Biotechnology Journal上发表了一篇名为「Transgene-free CRISPR-/Cas9-mediated gene editing through protoplast-to-plant regeneration enhances active compounds in Salvia miltiorrhiza.」的研究论文。文章中详述建立第一个丹参的原生质体再生系统过程(图一)。

(图一. 丹参的原生质体再生)

　　这个系统能够利用体外组装的sgRNA-Cas9 核糖核蛋白复合物(RNP)或携带 CRISPR/Cas9 编辑系统的质粒，作为基因编辑工具，通过短暂性转染，对于代谢途径的数个转录因子序列，完成一个或多个目标位点的编辑，从而获得生物活性化合物产量的提高、且无外源DNA导入的被编辑子代。相对于其他无外源基因编辑法，原生质体再生配合RNP的编辑的效率可达50%.与在该团队于野生番茄及其他植物的结果相似(Lin et al. 2022, Plant Physiology). 作者检测这些转录因子被敲除子代的表型，丹参酚酸与丹参酮合成正调控因子MYB98敲除株，根部颜色较浅; 反之负调控因子bZIP1与bZIP2敲除株具有更深的红色根系和更高水平的生物活性化合物含量(图二)。

(图二. 生长室中培养的 3 个月大野生型和敲除突变体的表型)

　　过去研究在毛状根中过表达MYB36可促进丹参酮的积累，同时降低酚酸水平。然而，MYB36主要在花中表达且与拟南芥的一些 与花青素合成相关之MYB 基因同源。作者自原生质体再生的MYB36 基因敲除植株和无性繁殖的扦插植物都开出了白色的花，这表明MYB36 不只会影响毛状根之有效成分生合成，亦是丹参紫花的花青素生物合成的正向调节因子(图三)。并且这个方法从转染到再生发育为植株约需6个月的时间。这些基因编辑植株可透过扦插方式进行无性繁殖，对编辑位置进行基因测序，证实不会产生镶嵌体，被编辑的位点可以稳定地遗传至所有扦插苗中。因此，所得的无外源基因的稳定遗传小苗可以直接进行种植与推广。这个平台将为丹参的研究及应用提供了极大的帮助。

(图三. 来自野生型和不同基因突变体的花 (上图) 以及来自 myb36 的两个独立再生敲除突变体的三种克隆繁殖植物的白花 (#20、#62; 下图)